近日，云南大学生科院任桂萍、党云琨、赖凡教授团队在国际权威期刊Nucleic Acids Research （IF 13.1）上发表了题为“RNA G-quadruplexes promote codon repeat-associated ribosomal frameshifting in human genes”的研究论文。该研究首次揭示了密码子重复相关核糖体移码（CRFS）的一种关键分子机制。通过构建HDAC1-CRFS报告系统，本研究证实密码子重复序列（如(UAC)3）可高效驱动核糖体移码。进一步通过全基因组CRISPR筛选，发现RNA结合蛋白RBM4能调控移码过程，并首次揭示其结构基础—紧邻密码子重复下游的RNA G-四链体（rG4）是移码必需的顺式调控元件。结合基因组分析，研究提出“密码子重复+下游rG4”是驱动人类基因组广泛发生程序性移码、产生跨框蛋白的一种普遍模式。新葡的京SURFSeq 5000平台以优良的产品质量，助力高分辨率核糖体图谱测序（Ribo-seq）与深度解析技术的开发与应用，为捕捉翻译动态过程中的精细事件提供了一流的技术保障。

背景介绍

程序性核糖体移码（PRF）是一种在病毒、原核及真核生物中广泛存在的翻译重编码机制，通过核糖体在特定位点的读框滑动产生具有重要功能的跨框蛋白。经典的负向1核糖体移码（-1 PRF）机制已被阐明，但正向1核糖体移码（+1 PRF）的机制研究尚不充分。值得注意的是，核糖体停滞是移码发生的共同核心环节，可由多种因素引发。近年研究发现，RNA G-四链体（rG4）作为一种重要的调控性二级结构，参与转录控制、翻译调控和RNA代谢。在非编码区（如5' UTR），rG4s可通过影响翻译起始、刺激内部核糖体进入位点（IRES）介导的翻译以及影响上游开放阅读框（uORF）的识别等过程抑制翻译，且有证据表明其插入终止密码子UGA下游时可促进-1 PRF。然而，rG4在编码区内的功能，尤其是其是否及如何参与翻译调控，仍不清楚。本团队前期工作发现，人类编码序列中广泛存在的短密码子重复（如(UAC)3）可介导一种新型PRF（密码子重复相关核糖体移码，CRFS），并产生具有生物学功能的跨框蛋白（如HDAC1-FS），但多数短密码子重复序列自身移码效率不高，提示存在未知的调控元件。为此，本研究旨在深入探究CRFS的分子机制，特别关注编码区rG4结构在其中的潜在作用。

成果解读

1、RBM4通过结合rG4序列促进HDAC1移码

本研究通过构建双荧光报告系统（ZsGreen/mCherry），建立了可特异性监测HDAC1基因+1位核糖体移码的细胞模型。利用全基因组CRISPR筛选结合流式分选技术，发现RBM4基因敲除可显著降低移码效率，提示RBM4为HDAC1移码的关键正调控因子。通过siRNA敲低及回补实验验证，证实RBM4蛋白水平与移码效率呈正相关，且该调控作用独立于其经典RNA剪接功能。结合生物信息学分析与Ribo-seq数据，初步揭示RBM4可能通过识别HDAC1 mRNA上的rG4结构调控翻译进程，为阐明程序性移码的分子机制提供了实验依据。

图1 RBM4促进HDAC1核糖体移码

2、RBM4结合HDAC1 mRNA中的RNA G-四链体结构

为深入验证RBM4通过rG4基序调控HDAC1 mRNA移码，研究团队通过生物信息学预测结合计算建模，首次在HDAC1 mRNA的移码核心区下游(UAC)3 5 nt鉴定到一个进化保守的rG4形成序列。圆二色谱分析证实该序列在生理条件下可折叠为平行拓扑的G-四链体结构，其构象稳定性受钾离子增强，且可被G4特异性配体TMPyP4浓度依赖性解折叠。利用PAR-CLIP公共数据与RNA免疫沉淀实验，我们进一步证实RBM4蛋白能够特异性识别并结合该rG4结构域。这些发现揭示了RBM4通过直接结合HDAC1mRNA的rG4功能元件调控核糖体移码的分子机制，为理解RNA高级结构介导的翻译重编程提供了关键实验证据。

图2 RBM4结合HDAC1 mRNA中的RNA G-四链体结构

3、HDAC1中的rG4是介导密码子重复相关移码的关键元件

通过P2A双荧光素酶报告系统、体外翻译实验及蛋白质印迹分析，系统证实rG4结构是HDAC1移码的关键调控元件。在HEK293T细胞中，rG4突变导致移码效率显著下降；兔网织红细胞与粗糙脉孢菌无细胞体系进一步验证该作用的普适性。蛋白质水平检测显示，野生型HDAC1可产生30 kDa跨框融合蛋白，而rG4突变体该条带完全缺失。这些结果从多维度确立了rG4在HDAC1程序性移码中的必要功能。

图3 HDAC1中的rG4是介导CRFS的关键元件

为阐明rG4结构在HDAC1移码中的动态调控机制，通过药理学干预直接验证了rG4结构稳定性与移码效率的紧密关联。使用高特异性rG4稳定剂PhenDC3可显著提升野生型HDAC1移码效率，而结构去稳定剂TMPyP4则显著抑制移码效率。在rG4关键位点突变（GG→CC）的序列中，两种化合物均无法显著改变移码效率，排除了非特异性药物效应的可能。这些发现确立了rG4作为HDAC1移码必需顺式元件的动态调控特性，揭示了RNA高级结构稳定性与翻译重编程之间的直接关联。

图4 rG4结构的稳定剂与去稳定剂可调控HDAC1的核糖体移码

4、rG4可促进其他含密码子重复基因的移码

通过跨基因功能置换实验，系统揭示了rG4结构作为程序性核糖体移码通用调控元件的分子基础。实验表明，将HDAC1来源的rG4序列插入LRRC17、SETD2等低移码效率基因中，可显著提升其移码效率；反之，将NRAS、Trf2及端粒TERRNA等多种来源的rG4序列引入不同基因背景后，均能有效促进移码发生。这些数据共同证明，rG4的移码调控功能具有结构普适性，不依赖于特定序列背景。该发现确立了rG4结构在不同遗传背景下均可作为有效的顺式元件促进+1程序性核糖体移码，为理解基因组中广泛存在的G4结构在基因表达调控中的功能提供了关键机制支撑。

图5 rG4序列有效促进CRFS

5、rG4基序与密码子重复协同促进人类基因组中的移码

全基因组分析显示，在40,037个密码子重复下游10 nt或150 nt范围内，rG4基序均存在显著富集，表明rG4与密码子重复在基因组层面存在明显关联。基于此，研究人员构建跨框肽段数据库并整合人类蛋白质组数据（涵盖32种正常组织），系统筛选出472个含有潜在移码位点且下游10 nt内存在rG4的基因。经严格质控与多重过滤，最终在34个基因中鉴定出48个高可信度移码位点，其中23条跨框肽段（对应21个独立位点）在全部32种组织中均被检测到，证实此类由rG4协同介导的移码事件具有广泛的组织普适性与生理相关性。对随机选取的FOXO3、HAX1和CRACR2B基因进行P2A双荧光素酶报告系统验证，证实其均存在显著移码；突变下游rG4基序关键G碱基可显著降低移码效率。综上证明，rG4序列是促进人类基因组中密码子重复处核糖体移码的常见顺式作用元件。

图6 rG4序列广泛促进CRFS

结论

1. 通过报告系统、体外翻译及蛋白质检测等技术，证实位于密码子重复下游的rG4结构是HDAC1发生移码的必要条件；

2. RNA结合蛋白RBM4是HDAC1移码的关键调控因子，并系统证明RBM4通过特异性识别并结合HDAC1 mRNA中的rG4结构域来促进核糖体移码；

3. rG4作为普遍顺式元件驱动人类基因组中广泛的密码子重复相关核糖体移码。

参考文献

Li X, Li Z, Zhou Y, et al. RNA G-quadruplexes promote codon repeat-associated ribosomal frameshifting in human genes[J]. Nucleic Acids Research, 2026, 54(2): gkaf1481.