文章梗概

近日，在国家重点研发计划“前沿生物技术”专项支持下，国家生物信息中心田晨曦研究员、湖南省肿瘤医院早期临床研究中心张永昌主任，联合北京寻因生物、新葡的京生物研发团队，在知名期刊Cell Discovery（IF 12.5）上发表了题为“Integrating single-nucleus barcoding with spatial transcriptomics via Stamp-seq to reveal immunotherapy response-enhancing functional modules in NSCLC”的重要研究成果。该研究是“基于微流控捕获与分选系统的超高通量单细胞多组学解析技术和仪器研发（项目编号：2023YFC3402700）”重点专项的关键产出之一，标志着我国在高精度空间转录组技术自主研发与应用转化方面取得重要突破。

本研究开发了Stamp-seq技术，利用定制高密度DNA测序芯片及限制性酶解空间条形码标记单个细胞核，实现物理意义上单细胞分辨率的空间细胞分析，并将其应用于NSCLC化疗免疫反应细胞生态系统的研究，揭示了特定浆细胞（IGHG1+浆细胞）的时空轨迹及潜在临床意义。新葡的京生物刘磊和李昭作为共同作者参与了本项研究，新葡的京SURFSpace空间芯片为Stamp-seq技术提供了强有力支持。此外，本研究中的Stamp-seq已完成商业转化，能够实现真正单细胞分辨率的空间定位和精准的转录组分析，揭示细胞间的复杂相互作用和组织结构。

背景介绍

破译细胞状态空间组织结构是理解发育、组织稳态和疾病的基础，空间转录组技术可实现转录本定位，但存在细胞边界推断难、基因检测率低和成本高等问题。癌症免疫疗法为部分非小细胞肺癌（NSCLC）患者带来显著疗效，然而大量患者未从中受益，因此急需用于患者分层和治疗优化的预测性生物标志物。单细胞转录组学等技术可研究免疫细胞动态但缺乏空间信息，传统空间转录组学又有细胞分割边界不清的局限，这凸显了开发新型空间转录组技术的必要性。

成果解读

1、Stamp-seq技术概述

Stamp-seq技术包括空间标记和细胞核测序两个核心阶段。空间标记阶段：生成含空间条形码和RNA捕获分子的物理芯片，每个条形码序列与芯片空间坐标对应，通过固相扩增、合成测序确定条形码序列及坐标，经激光分割成5.5 mm×15.5 mm区域并粘附于玻璃载玻片组装成Stamp-seq芯片。芯片各区域的空间标签簇形态和密度一致，标签簇平均间距1.64 μm，直径1.35 μm，重复率约0.03%，可确保核标记多样性。细胞核测序阶段：将14-20 μm厚的组织切片置于芯片上，通过酶解释放空间条形码片段对细胞核原位标记，标记后的细胞核经提取、多重条形码标记、液滴封装、文库构建及高通量测序，最终生成单核空间基因表达矩阵。

图1 Stamp-seq工作流程及芯片制备的示意图

2、Stamp-seq揭示小鼠大脑细胞结构及其方法学比较

为验证Stamp-seq空间技术有效性，研究对小鼠海马14 μm冠状切片进行分析，在42 mm2组织中分离测序42,449个细胞核，32,833个（77.3%）成功定位。经聚类注释发现，细胞簇空间分布符合预期，基因空间表达谱与原位杂交数据高度吻合。该技术通过两阶段计算框架实现精准定位，空间标签扩散距离多在17 μm内，与DAPI图像真实位置平均偏移仅4 μm，显著优于随机定位；内皮细胞定位与血管解剖结构高度契合，佐证细胞类型定位准确性。质量评估显示，空间标记程序不影响细胞类型比例、基因表达量等核心指标。与HDST、Slide-seqV2、Visium-HD、Slide-tags、Stereo-seq等多种先进技术对比，Stamp-seq UMI和基因检测灵敏度优于多数技术，且基于核标记的设计解决了同类技术亚型转录组聚集局限性。其marker共表达模式与金标准snRNA-seq数据的一致性显著高于其他空间方法，证明该技术能减少转录本交叉污染，实现细胞亚群的精细区分。

图2 Stamp-seq技术实现小鼠单细胞核空间转录组学分析

3、Stamp-seq在NSCLC研究中的应用成果

免疫疗法虽革新了癌症治疗，但仍有许多患者无应答。免疫细胞群落调控免疫细胞的招募、激活和耗竭，从而影响疗效。单细胞测序仅描述亚型变化，传统空间转录组学因细胞分割不清，无法精确定义肿瘤免疫微环境。为此，对新辅助治疗后的NSCLC样本切片进行了Stamp-seq分析，包含12份样本，按患者反应分层：3例pCR，4例MPR，5例非MPR。

❖Stamp-seq鉴定化疗免疫疗法反应相关细胞和细胞群落

Stamp-seq分析了约120,000个细胞核的转录组和空间信息。聚类分析显示多种细胞群，包括间质、骨髓、淋巴、内皮和上皮细胞。根据CNV评分和KRT9的表达将上皮细胞进一步分为恶性和正常群。比较pCR和NpCR（包含MPR和非MPR）组，pCR组富集淋巴细胞和淋巴内皮细胞，NpCR组富集髓系细胞和上皮细胞。值得注意的是c17肿瘤亚群在pCR中显著富集。Hallmark通路分析显示pCR中肿瘤细胞增殖通路活性降低，但炎症信号升高，表明残留的肿瘤细胞（例如c17亚群）可能激活抗肿瘤程序。利用GraphSAGE进行空间邻域分析以识别与治疗反应相关的细胞群落特征，共划分出五个细胞龛：D1髓细胞丰富、D2上皮细胞区、D3血管内皮区、D4浆细胞和淋巴内皮中心、D5 H&E染色显示TLS特征的T/B细胞丰富区域。细胞邻近性分析支持上述分区，上皮亚群呈内聚聚类，T细胞与B细胞聚类，浆细胞与apCAFs邻近；量化结果显示D3和D4空间分布重叠分散，D5空间隔离。比较分析发现，pCR组富集D4/D5淋巴细胞微环境，NpCR组以D1髓系微环境为主，证实T细胞浸润和TLS与良好结局相关，髓系积聚则与治疗抵抗相关。

图3 Stamp-seq技术可实现NSCLC患者的物理水平上的单细胞空间分析

❖ Stamp-seq分析成纤维细胞亚型的空间功能异质性

成纤维细胞是具有高度可塑性和表型异质性的基质细胞，是调节免疫反应的关键微环境成分。Stamp-seq以单核分辨率鉴定出7种功能不同的成纤维细胞亚型，其空间分布与治疗反应密切相关：pCR样本中ROBO2+ CAFs在D2生态位优先积聚，而ACTA2+/COL1A1+ myCAFs主要富集于NpCR样本。这与已报道的ROBO2+ CAFs的肿瘤抑制作用一致。相反，myCAFs通过排斥CD8+ T细胞和抑制免疫浸润，参与免疫抑制TME形成。通过量化pCR样本中CAFs相对于TLS中心点的径向定位，剖析了D5区CAFs的区隔结构。空间图谱显示，apCAFs定位在TLS核心，RMRP+和ALDH1A3+ CAFs则占据了邻近T/B细胞集群的皮质旁区域。ROBO2+ CAFs主要位于TLS外围与浆细胞共定位，而myCAFs不存在。这种分层组织表明了功能特化：apCAFs可能启动TLS形成，RMRP+/ALDH1A3+ CAFs支持淋巴细胞分化，ROBO2+ CAFs促进浆细胞迁移。myCAFs被排除在TLS外，强调其免疫逃避作用，与NpCR富集一致。

图4 Stamp-seq揭示了与化学免疫治疗反应相关的成纤维细胞微环境

❖ 利用Stamp-seq分析浆细胞轨迹与治疗应答的关联

分析D2肿瘤区域非上皮细胞差异表达基因的细胞来源，以确定与治疗反应相关的肿瘤微环境动态。pCR组中上调基因主要由浆细胞表达，而NpCR组则主要来源于CAFs和内皮细胞。浆细胞分IGHG1+和IGHA1+两组，IGHG1+细胞更靠近肿瘤细胞，这与之前报道IgG+浆细胞改善免疫治疗，IgA+浆细胞抑制免疫的结果一致。pCR样本所有区域的IGHG1/IGHA1比值均高于NpCR，在D5区域达到峰值。因此推测IGHG1+浆细胞生成和招募驱动pCR患者的抗肿瘤免疫。

为探究驱动浆细胞生成的通路，将pCR和NpCR组进行通路比较发现pCR组肿瘤D5区低氧信号升高，所有淋巴细胞缺氧活性增加，IGHG1+浆细胞表现出更强的缺氧反应和更高的糖酵解活性，而缺氧和糖酵解活性升高有利于B细胞分化为产生IgG的浆细胞，这意味着TLS相关缺氧可能会驱动浆细胞过度生成，从而提高免疫疗法的疗效。

进一步开发BCR空间谱分析技术，确定浆细胞克隆型和时空轨迹，发现两条迁移路线：D5→D4→D2和D3→D4→D2。pCR样本在迁移过程中始终保持高IGHG1/IGHA1比值，NpCR样本则从D4开始该比值衰减。因此推测D4是IGHG1+细胞富集的“中转枢纽”。为进一步探究招募机制，作者计算了浆细胞的治疗反应相关细胞邻域。结果发现D4区域的apCAFs高表达HMGB1，IGHG1+浆细胞高表达CXCR4，HMGB1作为CXCL12的辅助因子增强CXCL12-CXCR4信号传导，介导apCAFs对IGHG1+浆细胞的特异性招募，并且这种相互作用在pCR组织中显著共定位。

最后，利用公开NSCLC数据集证实apCAF 特征单独或与 IGHG1/IGHA1 比值组合，与治疗反应改善和无进展生存期（PFS）延长显著相关，两者组合的AUC值可达 0.831，提示 IGHG1+浆细胞龛可作为化疗免疫疗法反应的良好预后生物标志物。

图5 Stamp-seq技术揭示NSCLC中促进治疗应答的浆细胞时空动态轨迹

Stamp-seq通过创新的核标记空间技术，在NSCLC化疗免疫治疗研究中揭示了抗肿瘤免疫反应的空间组织机制：apCAFs在D4区域通过HMGB1-CXCR4相互作用，招募来自TLS（D5）或血液循环（D3）的IGHG1+浆细胞，最终促进其向肿瘤细胞区（D2）迁移，形成抗肿瘤免疫应答。同时，成纤维细胞亚型的空间分布差异也调控着治疗反应，ROBO2+ CAFs与良好预后相关，myCAFs则介导免疫抑制。

该技术虽存在核回收率（10%-37%）和基因检测深度略低于Slide-tags等局限，但通过优化核提取技术、采用可逆固定方案及探针杂交策略等可进一步改进。未来，Stamp-seq有望为人类疾病诊断和预后模块开发提供有力工具，为NSCLC患者的治疗分层和个体化治疗策略制定提供重要依据，也为其他癌症的免疫疗法机制研究和生物标志物发现开辟新路径。

结论

1. 本研究开发并验证了Stamp-seq新型空间转录组技术，通过细胞核原位标记，首次实现了物理层面的单细胞分辨率空间分析，在检测灵敏度和细胞亚型区分能力上优于现有多种空间组学方法；

2. 本研究揭示了NSCLC免疫治疗应答的关键空间机制，IGHG1+浆细胞在特定微环境（D4区域）被apCAFs通过HMGB1-CXCR4信号通路招募，并向肿瘤区域迁移，从而促进抗肿瘤免疫；

3. 本研究解析了成纤维细胞空间异质性对治疗结局的影响，ROBO2+ CAFs在应答者中富集于肿瘤区域并与浆细胞共定位，而ACTA2+/COL1A1+ myCAFs在无应答者中积聚且被排除在三级淋巴结构之外，证实了基质细胞的空间分布具有重要预后意义。

参考文献

Pan YT, et al. Integrating single-nucleus barcoding with spatial transcriptomics via Stamp-seq to reveal immunotherapy response-enhancing functional modules in NSCLC[J]. Cell Discovery, 2026, 2.